所以直標(biāo)一抗的價(jià)值在于“省步驟、降交叉反應(yīng)"，代價(jià)是信號(hào)可能偏弱；間接法信號(hào)強(qiáng)，但多色時(shí)二抗種屬搭配會(huì)迅速變得復(fù)雜。而mIHC的出現(xiàn)，某種意義上就是為了跳出這道選擇題。

當(dāng)你想看懂腫瘤微環(huán)境，例如：免疫細(xì)胞有哪些亞群、它們?cè)谀摹⒂袥](méi)有貼著腫瘤細(xì)胞、彼此的空間關(guān)系如何。此時(shí)，傳統(tǒng)熒光的局限性就體現(xiàn)出來(lái)了：熒光素光譜重疊導(dǎo)致可用通道有限；二抗種屬組合也撐不起更多顏色。

因此，mIHC應(yīng)運(yùn)而生。它的核心是TSA酪胺信號(hào)放大技術(shù)：一抗結(jié)合抗原，HRP標(biāo)記二抗識(shí)別一抗，加入酪胺-熒光素底物后，HRP在H?O?存在下催化酪胺生成高活性自由基，自由基迅速共價(jià)結(jié)合到抗原附近的酪氨酸殘基上，熒光素被“沉積"在抗原位點(diǎn)——信號(hào)因此被放大。TSA的信號(hào)放大能力極為可觀，理想條件下可達(dá)傳統(tǒng)熒光信號(hào)的10-100倍。

這種共價(jià)結(jié)合極其穩(wěn)定，使得后續(xù)可以用熱修復(fù)洗去前一輪結(jié)合的抗體，再進(jìn)行下一輪染色，而對(duì)前一輪的熒光信號(hào)影響較小。mIHC還進(jìn)一步解決了熒光重疊的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)每個(gè)像素的光譜進(jìn)行線性解混，光譜顯微鏡可以區(qū)分常規(guī)顯微鏡下無(wú)法分辨的信號(hào)，同時(shí)有效降低組織自發(fā)熒光帶來(lái)的背景噪聲。這使得mIHC可以在一張切片上同時(shí)分析7種甚至更多蛋白的空間分布關(guān)系。因此，mIHC解決了傳統(tǒng)免疫熒光的兩個(gè)硬傷：

1.突破種屬限制：mIHC 采用輪次循環(huán)染色，每一輪染色完成后洗脫全部抗體復(fù)合物，再開(kāi)展下一輪，因此不同輪次之間可以使用相同種屬的一抗；但同一輪次內(nèi)，一抗與 HRP 標(biāo)記二抗仍需要種屬匹配；

2.突破顏色限制：標(biāo)記數(shù)量取決于循環(huán)輪數(shù)，雙標(biāo)三色、六標(biāo)七色都可以實(shí)現(xiàn)。

mIHC同時(shí)帶來(lái)了空間分析能力：多個(gè)標(biāo)記在同一組織中的分布關(guān)系、細(xì)胞亞群相鄰關(guān)系、腫瘤微環(huán)境組成，都能在同一張切片上定量回答。